（1）蛋白提取

蛋白質提取是生物化學研究中的一項基本且關鍵技術，其目的是將目標蛋白質從細胞或組織中分離出來，同時保持其結構和功能不受損害。

細胞通過裂解液處理，釋放出蛋白質。加入含有SDS和還原劑的蛋白上樣緩沖液后，蛋白質的空間結構解離變性，形成蛋白質-SDS復合物，通過SDS-PAGE電泳根據分子量大小分離蛋白質。蛋白提取過程中常用的試劑包括洗滌液（如PBS、TBS、生理鹽水等）、裂解液（含緩沖體系、鹽離子、離液劑等）、酶抑制劑和上樣緩沖液。裂解液的選擇對蛋白提取至關重要。例如，RIPA裂解液適用于總蛋白的提取，而特異性更強的裂解液可用于提取特定類型的蛋白質。

蛋白定量可以方便后續WB實驗的檢測，用于確定樣品中蛋白質的含量和表達趨勢。常用的蛋白定量方法包括Bradford法、Lowry法、BCA法等，實驗室常用BCA法進行定量。

BCA法：基于雙縮脲原理，蛋白質將Cu2+還原成Cu+，BCA與Cu+形成藍紫色復合物，在562nm波長處有吸收峰，顏色深淺與蛋白質濃度成正比。優點是不易受一般濃度去污劑的干擾；抗干擾能力強。缺點是可受螯合劑，高濃度還原劑的影響；靈敏度可達到0.5-20μg/mL，受到螯合劑、還原劑等的干擾。在選擇蛋白定量方法時，需要考慮樣品的組成和可能存在的干擾物質。蛋白定量的標準操作流程通常包括制備標準曲線、樣品制備、加入定量試劑、孵育、測量吸光度、繪制標準曲線和計算蛋白質濃度。

 

（2）蛋白免疫印記（Western blot）

蛋白免疫印記（Western Blot，WB）是一種用于檢測特定蛋白質表達的實驗技術。它通過以下步驟實現：

樣品準備：細胞或組織被裂解以提取蛋白質，這一步驟需要在低溫條件下進行，以防止蛋白質降解，并常加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白質水解。

蛋白質定量：使用BCA法等方法來定量樣品中的蛋白質含量，以確保電泳時各樣品的蛋白質量一致。

SDS-PAGE電泳：樣品經加熱處理后，蛋白質被SDS（十二烷基硫酸鈉）覆蓋并帶上負電荷，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按分子量大小分離。

轉膜：將凝膠中的蛋白質轉移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，這一過程通常在濕式或半干式條件下，通過電場力實現。

封閉：為防止抗體非特異性結合，膜需用封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA溶液）處理，封閉膜上的疏水結合位點。

一抗孵育：膜與針對目標蛋白的特異性一抗孵育，一抗與目標蛋白特異性結合。

洗滌：去除未結合的一抗，通常使用TBST或TBS緩沖液進行多次洗滌。

二抗孵育：使用標記有酶（如辣根過氧化物酶HRP）或熒光團的二抗與一抗結合，二抗能夠放大信號并使檢測成為可能。

顯色：通過化學發光（ECL）、底物顯色（如DAB）或熒光等方法使膜上的蛋白質帶顯色，從而捕獲發光信號。

數據分析：通過比較不同樣品的條帶強度，可以半定量地分析蛋白質的表達水平。

Western Blot技術廣泛應用于檢測特定蛋白質的表達、鑒定蛋白質的分子量、研究蛋白質的修飾狀態（如磷酸化）以及蛋白質相互作用分析等領域。通過這種方法，研究人員可以從復雜的蛋白質混合物中鑒定和定量目標蛋白質，從而獲得有關其表達模式和生物學功能的寶貴信息。

 

（3）酶聯免疫吸附（ELISA）

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是一種基于抗原-抗體反應的免疫學檢測技術，它利用了酶的催化作用來放大信號，從而實現對特定抗原或抗體的定性和定量分析。ELISA技術具有高靈敏度、高特異性、操作簡便、成本相對較低等優點，廣泛應用于生物醫學研究、臨床診斷、食品安全檢測等領域。

ELISA的基本原理： ELISA技術的核心在于抗原或抗體的固相化和酶標記的抗體或抗原。首先，將抗原或抗體固定在固相載體（如微孔板）上，然后加入待測樣品。待測樣品中的特定抗體或抗原會與固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。接著，加入酶標記的二抗體或抗原，使其與第一步中形成的抗原-抗體復合物結合。最后，加入酶的底物，酶催化底物轉化為有色產物，通過測定顏色的深淺可以定性或定量分析樣品中特定抗原或抗體的含量。

ELISA的類型：

直接ELISA：抗原直接固定在固相載體上，然后加入酶標記的一抗體進行檢測。

間接ELISA：抗原固定在固相載體上，先加入一抗體，再加入酶標記的二抗體進行檢測。

夾心ELISA：兩種抗體分別固定在固相載體上和標記在酶上，它們分別識別抗原的不同表位，形成“夾心”結構。

競爭ELISA：酶標記的抗原和待測抗原競爭與固相抗體的結合，用于定量分析抗原。

抗體捕捉ELISA：利用抗抗體的抗體捕獲特定抗體，常用于IgM抗體的檢測。

ELISA的操作步驟：

包被：將抗原或抗體固定在固相載體上。

封閉：用封閉液（如含BSA的PBS）封閉未結合的位點，防止非特異性結合。

孵育：加入待測樣品和酶標記的抗體，進行溫育以允許抗原-抗體反應。

洗滌：用洗滌液洗去未結合的抗體或抗原。

顯色：加入酶的底物，酶催化底物轉化為有色產物。

終止反應：加入終止液（如硫酸）停止酶反應。

讀數：用酶標儀測定吸光度，根據標準曲線計算樣品中抗原或抗體的含量。

ELISA的靈敏度取決于酶的催化效率、底物的濃度、反應時間以及樣品中抗原或抗體的濃度。通過優化實驗條件，可以實現皮克級甚至更低濃度的檢測。ELISA的特異性則依賴于抗體的親和力和特異性，單克隆抗體因其高度特異性而常用于ELISA。內源性干擾物質（如類風濕因子、補體、高濃度的非特異免疫球蛋白等）可能會影響ELISA的結果，導致假陽性。因此，實驗中可能需要采取措施來減少這些干擾，如稀釋樣品、改變酶標抗體、使用變性IgG預封閉RF等。

總的來說，ELISA是一種強大的工具，可以在研究和診斷中提供重要信息。通過優化實驗條件和選擇合適的試劑，可以獲得可靠和準確的結果。

 

（4）免疫組化（IHC）

免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）是一種利用抗原-抗體反應原理，在組織切片或細胞涂片上檢測特定抗原（通常是蛋白質）的技術。通過這種技術，可以確定組織中是否存在某種特定的蛋白質，并能夠了解該蛋白質在組織中的位置和相對數量。這對于研究疾病的診斷、病理生理學和藥物研發等方面具有廣泛的應用。

免疫組化技術的原理： 免疫組化技術基于抗體與抗原之間的高特異性結合。首先，從待檢測的組織或細胞中提取蛋白質作為抗原，通過免疫動物獲得特異性抗體。然后，利用這些抗體探測并結合組織或細胞中的相應抗原。最后，通過顯色劑標記的二抗檢測，對細胞復染顯示細胞輪廓，通過顯微鏡觀察，實現對組織或細胞內蛋白的定性、定位研究。

免疫組化技術的應用：

腫瘤診斷與鑒別：通過特定的抗體標記出細胞內相應抗原成分，以確定細胞類型，如角蛋白是上皮性標記，前列腺特異性抗原僅見于前列腺上皮。

辨認細胞產物：利用某些細胞產物為抗原制備的抗體，可作為相應產物的特殊標記，如內分泌細胞產生的各種激素。

了解分化程度：大多數標記物都有其特定的分布部位，如上皮細胞膜抗原（EMA）著色部位在細胞膜上。

鑒定病變性質：通過標記Ig輕鏈（κ、λ）可區分部分B細胞性淋巴瘤與B細胞反應性增生。

發現微小轉移灶：某些癌的早期轉移有時與淋巴結內竇性組織細胞增生不易區別，免疫組化方法有助于微?。ò┺D移灶的發現。

探討腫瘤起源或分化表型：一些來源不明的腫瘤通過免疫組化標記取得共識。

確定腫瘤分期：判斷腫瘤是原位還是浸潤及有無血管、淋巴管侵襲與腫瘤分期密切相關。

指導治療和預后：免疫組化標記中與預后有關的標記大致可分為三類：類固醇激素受體、腫瘤基因標記、細胞增殖性標記

免疫組化技術因其特異性強、靈敏度高、定位準確等特點，在病理診斷中發揮著越來越重要的作用。
 

（5）免疫熒光（IF）

免疫熒光（Immunofluorescence，IF）是一種在細胞或組織水平上檢測特定蛋白質的定性和定位分析技術。它基于抗原-抗體反應的原理，使用熒光標記的抗體作為探針來檢測目標抗原。以下是免疫熒光實驗的基本步驟和一些關鍵點：

①細胞準備：

對于貼壁細胞，將細胞接種到處理過的蓋玻片上，待細胞生長后取出蓋玻片進行后續操作。

對于懸浮細胞，可以通過離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

②固定：

根據實驗需要選擇適當的固定劑，如多聚甲醛或甲醇。固定后，細胞可保存于含疊氮鈉的PBS中4℃。

洗滌細胞3次，每次5分鐘。

③通透：

如果目標抗原在細胞內，需要對細胞進行通透處理，以使抗體能夠到達抗原。

常用的通透劑包括Triton X-100、Saponin等。

④封閉：

使用封閉液（如1% BSA）對細胞進行封閉，以減少抗體的非特異性結合。

⑤抗體孵育：

一抗孵育：根據抗體說明書建議的比例稀釋抗體，進行孵育。

二抗孵育：使用熒光標記的二抗進行孵育，形成抗原-抗體-熒光復合物。

⑥封片及熒光觀察：

使用抗熒光衰減封片劑進行封片，然后通過熒光顯微鏡觀察和采集圖像。

在實驗過程中，需要注意以下幾點：

所有試劑的滴加應準確、快速、足量，避免干片。

從二抗孵育開始，后續步驟都需避光操作。

染色完成后需及時觀察并采集圖像，避免熒光物質淬滅。

免疫熒光技術可以用于多種應用，包括病原體檢測、自身抗體檢測、腫瘤相關抗原鑒定、細胞表面抗原與受體檢測等。通過多色免疫熒光技術，還可以同時檢測多個蛋白，獲取共定位和表達熒光圖像，這對于了解蛋白質在細胞內的分布和相互作用非常重要。

 

（6）免疫共沉淀（CO-IP）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種基于抗體和抗原之間專一性作用的經典方法，用于研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用。這種方法可以在細胞內天然狀態下捕獲蛋白質復合物，提供關于蛋白質相互作用的直接證據。

實驗原理： Co-IP實驗的原理是在非變性條件下裂解細胞，保留細胞內蛋白質間的相互作用。通過使用特定抗體沉淀目標蛋白質（稱為誘餌蛋白），任何與該蛋白質在體內結合的蛋白質（稱為靶蛋白）也會被一同沉淀。隨后，可以通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，再用Western blot（WB）檢測沉淀中是否存在特定的靶蛋白，從而證實蛋白質間的相互作用。

實驗流程：

①樣品準備：收集細胞或組織，進行裂解處理，選擇合適的裂解緩沖液以確保蛋白質的溶解和穩定性。

②抗體選擇：選擇與目標蛋白具有高親和力和特異性的抗體。

③免疫沉淀：將抗體與裂解液中的蛋白質孵育，允許抗體與目標蛋白形成復合物。

④純化與清洗：使用蛋白A或G結合的磁珠或瓊脂糖珠捕獲抗體-蛋白質復合物，并通過洗滌去除非特異性結合的蛋白質。

⑤蛋白質分析：通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質，使用WB或質譜分析等方法對沉淀的蛋白質進行分析和鑒定。

實驗注意事項：

確?？贵w的質量和特異性，以減少非特異性結合。選擇合適的裂解緩沖液，以保持蛋白質的天然構象和活性；設置嚴格的對照實驗，以評估和排除假陽性結果；優化實驗條件，如抗體濃度和孵育時間，以獲得最佳結果 。

Co-IP實驗是研究蛋白質相互作用網絡的重要工具，它在揭示細胞內復雜蛋白質網絡、解析蛋白質復合物結構與功能等方面發揮著關鍵作用。通過這種方法，研究人員可以深入了解蛋白質如何在細胞內相互作用，形成功能性復合物，并參與調控生命活動的各種過程。