（1）引物設計與合成

qPCR實驗中，引物設計也是非常重要的一個環節，引物的合適與否與擴增效率是否達標、擴增產物是否特異、實驗結果是否可用等息息相關。設計qPCR引物時，通常要留意以下幾點：引物盡量要跨內含子設計、產物長度100~300 bp、Tm值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近、引物末端最好是G或C等等。

1. 引物跨內含子設計

在設計qPCR引物時，選擇跨內含子設計的引物可以使gDNA模板不能得到擴增，產物均來源于cDNA的擴增，這樣也就去除了gDNA污染造成的影響。

2. 引物長度

引物長度一般在18~30 nt之間，擴增產物長度盡量控制在 100~300 bp之間。

引物設計太短會導致非特異擴增，太長則容易形成二級結構(如發夾結構)。擴增產物太長不適于聚合酶進行反應，會影響到PCR擴增效率。

3. GC含量和Tm值

引物GC含量控制在40%~60%之間，過高或過低都不利于引發反應。正反向引物GC含量應接近相同，以便獲得相同的 Tm值和退火溫度。

Tm值應盡量在55~65℃之間，一般為60℃左右，上下游的Tm值應盡量姐接近，最好不超過4℃。

4. 引物3′端末端避免選擇A

引物3′端錯配時，不同堿基引發合成效率存在著很大的差異，當末位堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能引發鏈合成，而當末位為T時，錯配引發效率大大降低。因此引物3′端盡量避免選擇A，最好選擇T。

若為探針引物，則探針5′端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時，G也可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號，從而導致假陰性的出現。

5. 堿基分布

引物中四種堿基的分布最好是隨機的，3′端避免超過3個連續的G或C，3個以上連續的G或C容易在GC富集序列區產生配對。

6. 引物設計區域應避開復雜二級結構。

擴增產物單鏈形成二級結構會影響PCR順利進行，可通過提前預測靶序列是否存在二級結構，盡量避開該區域設計引物。

7. 引物自身和引物之間應盡量避免堿基連續互補。

引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊形成發夾結構，而影響引物與模板的復性結合。

上下游引物之間也不能存在互補序列，引物之間互補會產生引物二聚體而降低PCR效率甚至影響定量準確性。如果引物二聚體及發夾結構不可避免，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5 kcal/mol）。

8. 引物擴增的是目標特異產物。

qPCR檢測最終目的是了解目的基因的豐度，如果出現非特異擴增，定量會不準確。所以設計好引物后，需要對其進行BLAST檢測，在序列數據庫中比對產物的特異性。
 

（2）核酸提取/純化

核酸是一類具有復雜結構和重要生物功能的生物大分子，主要由核苷酸單元組成。核苷酸是由磷酸基團、五碳糖和一種氮堿基組成的分子。這些核苷酸單元通過磷酸二酯鍵連接在一起，形成長鏈，構成核酸的基本結構。在生物體中，核酸主要承擔著存儲和傳遞遺傳信息的重要角色，對生物體的生長、發育和功能發揮至關重要。抽提樣本中的DNA、RNA，為下游實驗提供高純度和高濃度的模板。

DNA樣本采集與保存的注意事項：

1 新鮮：新鮮樣本中受到內源性核酸酶影響相對最小，得到DNA質量相對更好。

2 適量：投入過多樣本，后續樣本裂解不充分從而影響DNA提取情況，還會引入過多雜質及內源性核酸酶。3 不同類型的樣本在采集與保存時會存在差異：

①動物組織保存時間：-20℃短期保存（1-3個月），-70℃長期保存；

②福爾馬林固定時間8-24h內為宜，樣本存放時間不宜超過1年；FFPE樣本保存溫度4℃，建議不超過3年。

③血液（全血）：可使用不同抗凝劑的抗凝管進行采集和保存；避免反復凍融，4℃短期保存3-4天，-20℃下可最多保存2年，全血、白細胞、血凝塊、血清或血漿-70℃下長期保存。

RNA樣本采集與保存的注意事項：

RNA穩定性差，極易降解，主要是由于內源性核酸酶（ribonucleaseRNAase）的作用，

a.固體組織樣本的儲存溫度：長期儲存的新鮮冰凍組織和 OCT包埋冰凍組織應儲存于液氮中，冰凍組織切片或者用于DNA和RNA提取的冰凍組織應儲存在-80℃。經過福爾馬林固定的石蠟包埋組織及組織切片應儲存在室溫，在低于 27℃的環境下，并控制蟲患和濕度。

b.液體樣本的儲存溫度：對于液體樣本，包括血液和尿液，樣本里的各種成分應在儲存前分離，使得每一種成分能夠在最佳條件下儲存。全血、血清、血凝塊、非淋巴細胞和血漿樣本應儲存在-80℃。血沉棕黃層和白細胞應儲存在液氮中。尿液應儲存在-80℃或者液氮中。

c.細胞的儲存溫度：長期保存的細胞系應儲存在液氮中。氣相液氮比液相液氮儲存樣本更好。雖然液相液氮的溫度更低一些（-196℃），但氣相液氮的溫度（-150℃）仍在臨界溫度之下。對于需要但沒有條件使用液氮保存的細胞樣本，應至少儲存-80℃環境中。

 

（3）逆轉錄

逆轉錄（reverse transcription），是以RNA為模板合成DNA的過程，合成的DNA稱為cDNA。逆轉錄過程遺傳信息的流動方向為RNA到DNA，與轉錄過程DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉錄，
RNA容易降解不易保存，為了方便后續的實驗與鑒定，酶促催化使RNA反轉錄為cDNA第一鏈。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與RNA雜交，然后由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成相應互補的cDNA拷貝，后者能進一步用于PCR擴增。依據實驗的不同目的，針對cDNA第一鏈合成的引物可根據特殊的靶基因設計，或可用隨機引物與所有mRNA雜交。

 

（4）PCR/RT-qPCR

PCR（聚合酶鏈式反應）是一種在體外快速、大量復制特定DNA片段的技術，其基本原理模擬了細胞內的DNA半保留復制過程。

DNA復制時，以親代DNA的兩條鏈分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下，按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，組成新的DNA分子，新形成的兩個子代DNA與親代DNA的堿基順序完全一樣。

PCR擴增原理主要為：①變性：PCR循環開始時，將含有模板DNA的反應體系加熱至90-96℃（通常為94℃），使DNA雙螺旋結構解旋成兩條單鏈，以便后續引物結合。②退火：降溫至45-65℃（典型值為50-60℃或針對特定引物優化的溫度），在這個階段，設計好的一對寡核苷酸引物與模板DNA單鏈上的互補序列結合。③延伸：在72-75℃條件下（通常為72℃），熱穩定DNA聚合酶（如Taq酶）從引物的3'端開始合成新的DNA互補鏈，沿模板方向進行延伸，生成新的雙鏈DNA分子。

通過電泳檢測擴增效果，并確認條帶大小與預期目標一致，必要時可通過測序驗證PCR產物的準確性。

RT-qPCR是指定量反轉錄聚合酶鏈反應，這里“RT”不是“實時”。與使用DNA模板的qPCR不同，RT-qPCR的起始材料是RNA，因此，在正常的qPCR擴增過程開始之前，實驗中包含一個逆轉錄步驟，將RNA轉換成cDNA。在基于染料的qPCR中，使用一種嵌入染料，在未結合時顯示微弱的熒光，當與dsDNA結合時增加到強熒光信號。SYBR® Green是最常用的dsDNA結合染料之一。熒光與存在的dsDNA數量成正比，能夠計算出原始模板數量，PCR過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數為Ct值，分析定量時目的基因Ct值取15-35較好，內參基因的Ct值一般在13-15左右較好。
最后根據實驗結果判斷Ct值、溶解曲線和擴增曲線等判斷數據是否可用，最后根據Ct值計算出樣本的表達水平差異倍數，再根據數據進行圖形繪制。

 

（5）質粒提取/轉染

基因研究中常需要通過上調靶基因的表達來觀察表型變化。過表達 (Over-Expression，OE) 是上調基因表達最常用的方法，其基本原理是將目的基因構建到質粒或病毒載體中，導入細胞內使基因的表達量增加。

使用質粒法過表達外源基因具有簡便、成本低和實驗體系成熟等優點，因此大多數實驗室會偏向于使用質粒法。

首先需要構建質粒，轉化，擴增，提取及鑒定。質粒的構建可經公司購買得到，一般同時提供陰性對照菌液及質粒。

構建質粒：利用限制性內切酶消化獲得線性化載體，PCR 擴增制備目的基因片段，所用擴增引物需在其 5' 端添加同源重組序列，使用該引物擴增基因片段，擴增產物 5' 和 3' 最末端的序列分別與線性化載體兩末端序列完全一致。以線性化載體和基因擴增產物配制反應體系，進行重組反應，實現體外環化。

轉化擴增：在感受態細胞中轉化，并在含有抗性的固體培養基培養，挑取單菌落擴菌培養。

質粒抽提鑒定：擴增結束后可按照質粒抽提試劑盒對質粒進行提取。質粒提取的目的是去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA 分開，隨后去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。按得到質粒 DNA 的量可將質粒抽提方法和試劑盒分為小提，中提，大提。小提簡便、快速，DNA獲得量在100-200ng/mL，適用于常規的載體構建；中提在小提基礎上進一步去除了菌液內毒素，DNA獲得量在0.7-1 μg/mL，適用于酶切、PCR、測序、連接、轉化、文庫篩選、體外翻譯、細胞轉染等；大提純化要求更高，使用配套純化柱，DNA獲得量在0.5-2 μg/mL，適用于慢病毒、腺相關病毒包裝，多數細胞轉染或其他需要大量質粒的實驗。

提取的目的基因過表達質粒和陰性對照質粒，進行測序 。將測序結果與目的基因序列進行比對分析，后續進行質粒轉染。
 

（6）慢病毒轉染

慢病毒轉染是一種常用的基因轉導技術，它能夠高效地將外源基因整合到宿主細胞的基因組中，通常不激活宿主細胞的免疫應答，這有助于維持長期穩定的基因表達，并且減少了宿主對轉染的排斥。

MOI（Multiplicity of Infection），即感染復數，是慢病毒轉染中一個重要的參數，它指的是在轉染過程中病毒顆粒的數量與宿主細胞數量的比值。MOI值的高低直接影響了病毒的感染效率和細胞的存活率。在正式實驗前，需要進行預實驗以確定最佳的MOI值，以達到理想的實驗效果。MOI值的設置通常從低到高，具體值需要根據目標細胞對病毒的敏感性、病毒載體的熒光強度以及實驗目的來確定。一般來說，較高的MOI值可以增加病毒感染的可能性，但同時也可能增加對細胞的毒性。可以通過設置不同的MOI梯度，觀察細胞狀態和熒光情況，來確定較適宜的MOI值。細胞的良好生長狀態是達到高感染效率的保證，因此在感染時需要確保細胞處于健康狀態。不同細胞系和不同類型的病毒載體可能需要不同的MOI值，因此在沒有文獻參考的情況下，建議首先設置較大梯度的MOI進行預實驗。

轉染主要包括以下步驟：

①目標細胞的準備：

鋪細胞：將目標細胞種植在適當的培養容器中，使其達到50-70%的融合度。

細胞狀態：確保細胞處于健康狀態，沒有污染。

②感染過程：

調整病毒濃度：根據MOI值計算所需的病毒體積，并用適當的培養基稀釋。

添加病毒：將稀釋后的病毒液添加到目標細胞中，輕輕搖勻。

輔助感染：為了提高感染效率，可以添加輔助感染試劑，如Polybrene。

③感染后處理：

培養：將細胞在含有病毒的培養基中培養一定時間（通常為4-6小時）。

更換培養基：去除含病毒的培養基，更換為新鮮完全培養基。

④感染效率的評估：

觀察：使用顯微鏡觀察細胞狀態，如果載體帶有熒光標記，可以通過熒光顯微鏡評估感染效率。

抗性篩選：如果慢病毒載體攜帶有篩選標記基因（如抗生素抗性基因），可以在感染后48-72小時通過加入相應的篩選劑（如Puromycin）來篩選出穩定表達外源基因的細胞株

⑤篩選穩定表達的細胞株：

根據篩選標記選擇合適的篩選劑濃度，進行細胞篩選。

篩選后的細胞需要擴增并進行進一步的表型和基因型分析。
 

（7）核酸分子雜交

核酸分子雜交是一種基于核酸分子堿基互補配對原則的技術，用于檢測和分析DNA或RNA分子之間的相互作用和相似性。這項技術在基因組學、分子生物學和醫學研究中有著廣泛的應用。

核酸分子雜交的基本原理是核酸雙鏈之間的互補配對，即堿基對配對（A-T和G-C）。當一條單鏈DNA或RNA探針與其互補的靶序列接觸時，探針會與靶序列雜交形成雙鏈結構。這種雜交可以在液相（如溶液中）或固相（如膜上）進行。

主要步驟包括：

①制備探針：選擇合適的探針序列，通常是與靶序列互補的一段核酸序列。探針可以通過化學合成或酶促反應制備，并進行標記（如放射性標記或熒光標記）。

②樣品處理：根據實驗類型處理樣品，例如DNA或RNA的提取和電泳分離，或組織切片的制備。

③雜交反應：將探針與樣品一起孵育，使探針與靶序列結合。雜交條件（如溫度和鹽濃度）需優化以保證特異性和靈敏度。

④檢測和分析：根據探針的標記方式，利用相應的檢測方法（如放射自顯影或熒光顯微鏡）檢測探針與靶序列的結合情況，并進行定量或定性分析。

應用：

基因檢測：通過分子雜交技術，可以檢測基因組中的特定基因突變或變異，應用于遺傳病的診斷和研究。

基因表達分析：通過Northern雜交，可以分析特定基因在不同組織或細胞中的表達水平，幫助理解基因功能和調控機制。

基因定位：熒光原位雜交（FISH）技術可以精確定位基因在染色體上的位置，應用于染色體結構異常的檢測和基因組圖譜繪制。

病原體檢測：通過檢測病原體特異的核酸序列，分子雜交技術可以快速準確地識別感染性病原體。