（1）脫鈣與軟化

組織脫鈣與軟化是病理學(xué)中常用的技術(shù)，特別是在處理含有鈣鹽的骨、牙齒及鈣化組織時。這些組織由于其硬質(zhì)特性，如果不進(jìn)行脫鈣處理，就無法進(jìn)行常規(guī)的切片操作。脫鈣的目的是使用化學(xué)或物理方法去除組織內(nèi)的磷酸鈣和碳酸鈣，使組織軟化，便于切片和后續(xù)的染色處理。

脫鈣的方法：

①硝酸脫鈣：這是一種快速脫鈣方法，通常用于HE染色，形態(tài)保持良好，但對抗原的破壞較嚴(yán)重，不適用于組織化學(xué)分析。硝酸脫鈣液的配方包括硝酸、冰醋酸、甲酸、水和甲醛。

②EDTA脫鈣：EDTA（乙二胺四乙酸）是一種有機(jī)螯合劑，能夠與鈣離子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)脫鈣。這種方法對抗原保存較好，適用于免疫組化、熒光等后續(xù)檢測，但脫鈣時間較長，需要數(shù)天至數(shù)周。

③鹽酸脫鈣：鹽酸脫鈣速度中等，脫鈣時間容易控制且不容易過度，因此在日常工作中最為常用。

④甲酸脫鈣：甲酸也是一種常用的脫鈣劑，適合骨髓組織脫鈣，但不適合皮質(zhì)骨的脫鈣

選擇合適的脫鈣方法和處理時間對于保證組織結(jié)構(gòu)的完整性和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。不同的脫鈣方法有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求和時間限制來選擇最合適的方法。

 

（2）組織固定/脫水

組織固定、脫水、透明是病理學(xué)中制備組織切片的重要步驟，它們對于保持組織結(jié)構(gòu)的完整性和進(jìn)行后續(xù)的染色分析至關(guān)重要。

組織固定：固定的目的在于保存組織，防止組織的自溶改變，保留抗原性，并提高組織成分的折射率。

常用的固定液包括10%中性福爾馬林（甲醛溶液），它對大多數(shù)病理標(biāo)本都具有良好的固定作用，穿透速度快，組織硬化程度小。小標(biāo)本一般固定4-6小時，大標(biāo)本則需要18-24小時。固定液在24小時內(nèi)不能穿透厚度大于2-3mm的實(shí)體組織，因此需要及時規(guī)范剖開標(biāo)本，確保重要檢查部位得到適當(dāng)?shù)墓潭ā９潭ㄒ旱牧恳话銘?yīng)為被固定標(biāo)本體積的5-10倍，以確保組織完全浸泡。

組織脫水：組織脫水的目的是將組織中的水分替換成石蠟，因?yàn)樗褪灢幌嗳埽梢员灰掖嘉眨掖加帜芘c二甲苯和石蠟相溶，所以通常使用乙醇和二甲苯作為脫水和透明的媒介。組織通常按照從低到高的濃度梯度進(jìn)行乙醇脫水，然后經(jīng)過二甲苯透明，最后浸入石蠟中。

需要注意的是：脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中的水分導(dǎo)致濃度降低，從而影響脫水效果。脫水時間需要根據(jù)組織的大小和性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整，通常各級乙醇中放置45分鐘到1小時。過度脫水會導(dǎo)致組織變硬，不利于后續(xù)的切片。脫水不徹底會導(dǎo)致透明時無法置換組織中水分，影響后續(xù)的浸蠟和切片質(zhì)量。組織在高濃度乙醇中停留時間過長可能會導(dǎo)致組織過硬、扭曲，影響切片。

透明：透明化的目的是將組織內(nèi)的脫水劑（通常是酒精）替換為能與石蠟相溶的溶劑，從而使石蠟?zāi)軌蝽樌虢M織中。這一步驟對于后續(xù)的石蠟包埋和切片至關(guān)重要。組織塊先經(jīng)過含有部分酒精和部分透明劑的混合液處理，以減少由于直接從酒精過渡到透明劑可能引起的組織收縮。例如，可以先使用50%酒精混合50%二甲苯的溶液。隨后，組織塊被轉(zhuǎn)移到純透明劑中進(jìn)行處理。二甲苯是常用的透明劑，它能夠迅速滲透組織，使組織變得透明。處理時間根據(jù)組織的大小和類型而定，通常在30分鐘至2小時之間。在純二甲苯中通常需要更換2次，總時間不超過3小時，以避免組織過度硬化和變脆。

 

（3）石蠟包埋/OCT包埋

組織包埋是病理學(xué)中制備組織切片的重要步驟，它涉及將組織固定、脫水、透明化后，浸入熔融的石蠟中，形成堅(jiān)硬的蠟塊，以便于后續(xù)的切片操作。石蠟包埋是將浸蠟的組織塊放入包埋框中，倒入熔融的石蠟，待石蠟?zāi)毯笕〕鱿瀴K。OCT是將組織浸入冷卻的OCT包埋劑中，確保沒有氣泡，然后在干冰上快速冷凍，儲存于-80℃。

OCT包埋的優(yōu)點(diǎn)在于它是一種水溶性的包埋劑，不會影響抗原的檢測，適合于需要進(jìn)行免疫組化等后續(xù)分析的組織樣本。而石蠟包埋則適用于需要長期保存和進(jìn)行HE染色等常規(guī)病理分析的組織樣本。
 

（4）石蠟切片/冰凍切片

將已包埋好的蠟塊切成小塊，每一小塊包含一塊材料。然后按照所需的切面，用單面刀片將小蠟塊切成梯形，并可粗視到材料切面。然后用燒紅的蠟鏟把蠟塊底部牢固的粘接在載蠟器上。用切片機(jī)（如旋轉(zhuǎn)切片機(jī)）將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶。切片時先把切片刀夾在刀架上，再把載蠟器夾在固定裝置上（注意安裝切刀的角度，刀口運(yùn)行方向與材料切面平行），然后調(diào)整好所需厚度，一般可在7~14微米，視材料和所需觀察對象而定，轉(zhuǎn)動切片機(jī)切片。切下來的切片經(jīng)過鏡檢（根據(jù)情況也可不檢），將符合要求的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時先在載玻片上滴上幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用撥針將切片伸直、展平，傾斜載片，使水流去并烘干。粘片后要經(jīng)過脫蠟、染色、再次脫水透明，然后封片永久保存。

冰凍切片取新鮮冷凍的材料，在樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預(yù)冷5-10分鐘讓OCT膠浸透組織。取下組織置于錫箔或玻片上，再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架上30分鐘。使用恒溫冰凍切片機(jī)，低溫室內(nèi)溫度以-15℃至-20℃為宜，進(jìn)行切片。切片時，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，切好后，室溫放置30分鐘，然后入4℃丙酮固定5-10分鐘，烘箱干燥20分鐘。

進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波熱修復(fù)也可，室溫自然冷卻。可用3%H2O2孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。冰凍切片技術(shù)因其快速、簡便的特點(diǎn)，在病理學(xué)診斷、免疫組化研究、組織化學(xué)分析和神經(jīng)科學(xué)研究等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

 

（5）蘇木精-伊紅染色（HE）

HE染色（Hematoxylin-Eosin staining），即蘇木精-伊紅染色，是病理組織切片中最常用的染色技術(shù)。它通過使用蘇木精和伊紅這兩種染液，清晰地顯示出組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型。以下是HE染色的基本原理和步驟：蘇木精是一種堿性染料，可將細(xì)胞核和細(xì)胞內(nèi)核糖體染成藍(lán)紫色，被堿性染料染色的結(jié)構(gòu)具有嗜堿性。伊紅是一種酸性染料，能將細(xì)胞質(zhì)染成紅色或淡紅色，被酸性染料染色的結(jié)構(gòu)具有嗜酸性。

步驟：

脫蠟：使用二甲苯去除切片中的石蠟。→水化：通過逐級酒精溶液使切片水化。→核染：使用蘇木精染液對切片進(jìn)行染色，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。→分化：使用鹽酸酒精溶液進(jìn)行分化，去除多余的蘇木精染料。→復(fù)染：使用伊紅染液對切片進(jìn)行染色，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。→脫水：通過逐級酒精溶液去除水分。→透明：使用二甲苯使切片透明。→將透明化的切片滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干后，貼上標(biāo)簽，切片標(biāo)本即可使用。

通過HE染色，可以在顯微鏡下清晰地觀察到組織結(jié)構(gòu)、組織類型、細(xì)胞層次等，對于病理診斷和研究具有重要意義。
 

（6）TUNEL染色

TUNEL染色（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling）是一種用于檢測細(xì)胞凋亡中DNA片段化的常用技術(shù)。其基本原理是在細(xì)胞凋亡過程中，DNA會在核小體間發(fā)生斷裂，形成大量的雙鏈或單鏈DNA缺口，這些斷裂的DNA鏈會產(chǎn)生大量的3'-OH末端。TUNEL染色通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將帶有熒光標(biāo)記的dUTP連接到DNA的斷裂處，從而在顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞的特征性染色，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的定性和定量分析。

TUNEL染色的關(guān)鍵步驟包括：

固定：使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海ㄈ?%多聚甲醛）固定細(xì)胞或組織，以保持細(xì)胞形態(tài)和DNA結(jié)構(gòu)的完整性。

通透：使用蛋白酶K等通透劑處理細(xì)胞或組織，以增加細(xì)胞膜通透性，使TUNEL反應(yīng)混合物能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

TUNEL反應(yīng)：在37℃下孵育，TdT酶將熒光標(biāo)記的dUTP添加到DNA的3'-OH末端。

洗滌：用PBS洗滌以去除未結(jié)合的試劑，減少背景噪音。

檢測：使用熒光顯微鏡觀察熒光信號，或使用光學(xué)顯微鏡觀察DAB等顯色底物產(chǎn)生的染色。

TUNEL染色技術(shù)因其高靈敏度和特異性，在檢測細(xì)胞凋亡方面得到了廣泛應(yīng)用。然而，它并不能區(qū)分凋亡和其他形式的細(xì)胞死亡，如壞死，因此在使用TUNEL染色時，可能需要結(jié)合其他方法來確定細(xì)胞死亡的類型。
 

（7）Masson染色

Masson染色（也稱為馬松染色）是一種用于顯示組織中纖維的染色方法，特別適用于觀察膠原纖維和肌纖維。Masson染色的原理基于陰離子染料分子的大小與組織的滲透性之間的關(guān)系。小分子量的染料可以穿透結(jié)構(gòu)致密、滲透性低的組織，而大分子量的染料則只能進(jìn)入結(jié)構(gòu)疏松、滲透性高的組織。在Masson染色中，肌纖維間隙較小，小分子染料如麗春紅可以滲透其中并染色，使其呈現(xiàn)紅色；而膠原纖維間隙較大，大分子量的染料如苯胺藍(lán)可以進(jìn)入并染色，使其呈現(xiàn)藍(lán)色或綠色。

染色步驟：

脫蠟至水：石蠟切片經(jīng)過二甲苯和逐級酒精處理，最后用自來水沖洗。

蘇木精染核：使用Regaud蘇木精染液或Weigert鐵蘇木素染色液對細(xì)胞核進(jìn)行染色。

鹽酸酒精分化：使用1%鹽酸酒精進(jìn)行分化，然后充分水洗。

麗春紅酸性復(fù)紅液染色：使用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液對肌纖維進(jìn)行染色。

冰醋酸水溶液洗：使用2%冰醋酸水溶液進(jìn)行短時間洗滌。

磷鉬酸水溶液分化：使用1%磷鉬酸水溶液對麗春紅、酸性復(fù)紅進(jìn)行分化。

苯胺藍(lán)或光綠液染色：使用苯胺藍(lán)水溶液或1%光綠水溶液對膠原纖維進(jìn)行染色。

脫水、透明、封片：最后通過酒精脫水、二甲苯透明化，然后用中性樹膠封固。

最后染色結(jié)果，膠原纖維或蛋白、粘液、軟骨呈藍(lán)色（如果使用光綠液則呈綠色），胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)和紅細(xì)胞呈紅色，胞核呈藍(lán)紫色。

 

（8）切片掃描

切片掃描技術(shù)通常涉及以下幾個步驟：

①使用全自動顯微鏡掃描平臺對玻璃切片進(jìn)行掃描。

②通過專業(yè)攝像頭捕捉圖像，并通過控制軟件進(jìn)行圖像的采集、處理和存儲。

③掃描得到的數(shù)字圖像可以進(jìn)行無縫拼接，生成包含所有組織信息的全視野圖像，即全切片圖像（WSI）。

切片掃描的優(yōu)勢：

自動化處理：單次可加載多張切片，并可不停機(jī)連續(xù)追加，提高掃描效率 。

高分辨率成像：系統(tǒng)通常具備真實(shí)雙物鏡電動轉(zhuǎn)換，提供超高分辨率和清晰度的圖像 。

一體化景深擴(kuò)展掃描：對于組織切片不平整的情況，可以進(jìn)行多層掃描后融合，提高圖像質(zhì)量 。

信息永久保存：數(shù)字切片可以永久保存，便于傳輸和交流，解決了傳統(tǒng)切片易損壞和難以長期保存的問題 。

遠(yuǎn)程會診：通過數(shù)字化切片，可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程病理診斷和學(xué)術(shù)交流，提高診斷的準(zhǔn)確性和效率 。

切片掃描技術(shù)的發(fā)展，不僅提高了病理診斷的效率和準(zhǔn)確性，也為病理學(xué)的教學(xué)和科研提供了新的工具和方法。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來數(shù)字病理將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。