（1）細(xì)胞復(fù)蘇/凍存

細(xì)胞凍存：

凍存原則為“慢凍”，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍，以減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成 。

凍存液一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO（5%~10%）組成，推薦凍存液配比為55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋40%胎牛血清＋5%DMSO 。

細(xì)胞凍存密度建議為200~500萬細(xì)胞/mL，以提高復(fù)蘇存活率 。

凍存操作方法包括使用程序凍存盒、無血清非程序凍存液和手動(dòng)梯度降溫 。

細(xì)胞復(fù)蘇：

復(fù)蘇原則為“快融”，即快速解凍以減少細(xì)胞所受損傷 。

復(fù)蘇步驟包括將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，快速投入37℃水浴鍋中，搖晃凍存管使其在1分鐘內(nèi)融化 。

融化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)基的離心管中，低速離心以去除DMSO，然后用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種至新的無菌培養(yǎng)器皿中 。

注意：DMSO作為冷凍保護(hù)劑，具有吸濕性，應(yīng)儲(chǔ)存于干燥環(huán)境中，避免使用開封1年以上的DMSO 。凍存管的蓋子必須擰緊，以防止凍存過程中液氮滲入凍存管中，造成污染或爆炸 。復(fù)蘇后的細(xì)胞需要一段時(shí)間恢復(fù)狀態(tài)，48小時(shí)內(nèi)不要換液，待細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度等恢復(fù)正常后再進(jìn)行細(xì)胞傳代等操作。

 

（2）細(xì)胞傳代

在科研服務(wù)中，細(xì)胞傳代是一項(xiàng)基礎(chǔ)且關(guān)鍵的技術(shù)，它涉及到細(xì)胞的擴(kuò)增、保存和恢復(fù)。以下是我們提供的細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)步驟和注意事項(xiàng)：

①傳代前的準(zhǔn)備：確保無菌操作臺(tái)（如超凈工作臺(tái)）已消毒并準(zhǔn)備好所有必需的無菌材料。預(yù)熱培養(yǎng)基和胰蛋白酶至37℃。

②胰蛋白酶消化：去除培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，并用PBS沖洗以去除殘留的培養(yǎng)基。加入適量的胰蛋白酶溶液，消化時(shí)間通常為1-5分鐘，具體時(shí)間取決于細(xì)胞類型。

③細(xì)胞吹打：使用無菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上脫落。

④細(xì)胞懸液制備：將吹打過的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心以去除上清液。向細(xì)胞沉淀中加入適量的完全培養(yǎng)基，吹打混勻。

⑤分瓶培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液按適當(dāng)比例分配到新的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

注意整個(gè)傳代過程必須在無菌條件下進(jìn)行，以防止微生物污染。消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免損傷細(xì)胞。

吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免產(chǎn)生氣泡。選擇合適的傳代比例，避免細(xì)胞過度擁擠或稀釋。記錄所有傳代和換液的詳細(xì)信息，以追蹤細(xì)胞生長(zhǎng)和健康狀態(tài)。

通過這些步驟和注意事項(xiàng)，我們可以確保細(xì)胞的健康生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代，為科研實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的細(xì)胞資源。
 

（3）細(xì)胞增殖/凋亡

細(xì)胞增殖和凋亡是細(xì)胞生物學(xué)中的兩個(gè)基本過程，它們?cè)谏矬w的生長(zhǎng)、發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。

細(xì)胞增殖檢測(cè)包括：

1. CCK-8實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖和毒性分析）

原理：CCK-8試劑中含有WST-8，能在細(xì)胞線粒體脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為黃色的甲瓚，其吸收值與活細(xì)胞數(shù)量成正比。這種方法可以用于細(xì)胞增殖、毒性分析和藥物篩選等 。

操作步驟：將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)。每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育0.5-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以評(píng)估細(xì)胞增殖情況。

2. EdU檢測(cè)法：

原理：EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，可以摻入到增殖細(xì)胞新合成的DNA中。通過檢測(cè)EdU的摻入，可以評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。

操作步驟：將細(xì)胞與EdU一起孵育，使其摻入細(xì)胞DNA。固定細(xì)胞并進(jìn)行通透處理。使用抗EdU抗體檢測(cè)摻入的EdU。通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)EdU陽性細(xì)胞。

3.BrdU檢測(cè)法：

原理：BrdU（5-溴脫氧尿苷）也是一種胸腺嘧啶核苷類似物，可以摻入到增殖細(xì)胞新合成的DNA中。通過檢測(cè)BrdU的摻入，可以評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。

操作步驟：將細(xì)胞與BrdU一起孵育，使其摻入細(xì)胞DNA。固定細(xì)胞并進(jìn)行通透處理。使用抗BrdU抗體檢測(cè)摻入的BrdU。通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)BrdU陽性細(xì)胞。

4.MTT實(shí)驗(yàn)：

原理：MTT（噻唑藍(lán)）在活細(xì)胞線粒體脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色的甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與細(xì)胞的增殖成正比。

操作步驟：將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔約1000-2000個(gè)細(xì)胞，100μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至合適的密度。每孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD值）。

5.細(xì)胞計(jì)數(shù)法：

原理：通過直接計(jì)數(shù)活細(xì)胞的數(shù)量來評(píng)估細(xì)胞增殖。

操作步驟：收集細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

檢測(cè)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)包括：

1.Annexin V-FITC/PI雙染法：

原理：利用Annexin V結(jié)合暴露在凋亡細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS），以及PI染色識(shí)別細(xì)胞膜完整性喪失的晚期凋亡或壞死細(xì)胞。Annexin V通常與FITC（熒光素）結(jié)合，而PI（碘化丙啶）則作為核酸染料。

操作步驟：收集細(xì)胞，用PBS洗滌后重懸于結(jié)合緩沖液中，加入Annexin V-FITC和PI染色，室溫避光孵育后使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。Annexin V陽性和PI陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞，而Annexin V和PI雙陽性的細(xì)胞則是晚期凋亡或壞死細(xì)胞。

注意事項(xiàng)：操作需避光，以保護(hù)熒光信號(hào)；Annexin V結(jié)合PS需要Ca2+的存在，因此緩沖液中應(yīng)含有Ca2+。

2.TUNEL染色：

原理：TUNEL染色利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將熒光標(biāo)記的dUTP添加到DNA斷裂的3'末端，從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡過程中的DNA片段化。

操作步驟：包括固定細(xì)胞、通透處理、TUNEL反應(yīng)、洗滌、封片和顯微鏡觀察等步驟。TUNEL陽性的細(xì)胞表明DNA存在斷裂，即發(fā)生凋亡。

注意事項(xiàng)：充分脫蠟和水化是關(guān)鍵步驟，以確保反應(yīng)充分、均勻；把握好細(xì)胞通透的時(shí)間，以確保酶和抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

3.細(xì)胞技數(shù)法：通過直接計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量也可評(píng)估細(xì)胞凋亡。

每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，選擇哪種方法取決于實(shí)驗(yàn)的具體需求和條件。

 

（4）細(xì)胞周期

檢測(cè)細(xì)胞周期的實(shí)驗(yàn)通常涉及使用流式細(xì)胞術(shù)來分析細(xì)胞的DNA含量，從而確定細(xì)胞在周期中的不同階段。以下是幾種常用的細(xì)胞周期檢測(cè)方法。

1.PI（碘化丙啶）染色法：

原理：PI是一種DNA結(jié)合染料，能發(fā)出與DNA含量成正比的熒光信號(hào)。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以分析細(xì)胞周期的各個(gè)階段。

操作步驟：收集細(xì)胞并用PBS洗滌。用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4℃下至少固定30分鐘。用含PI和RNase的溶液染色，以消除RNA的干擾。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通常用488nm激光激發(fā)PI，收集610nm左右的發(fā)射光。

2.Hoechst 33342染色法：

原理：Hoechst 33342是一種活細(xì)胞DNA染色劑，可以用于分析活細(xì)胞周期。

操作步驟：收集細(xì)胞并用PBS洗滌。使用含Hoechst 33342的PBS溶液染色。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用355nm激光激發(fā)Hoechst 33342，收集450nm左右的發(fā)射光。

3.EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入法：

原理：EdU是一種胸腺嘧啶類似物，可以摻入到正在合成的DNA中，通過檢測(cè)EdU的摻入可以分析細(xì)胞周期中的S期。

操作步驟：將細(xì)胞與EdU一起孵育，使其摻入細(xì)胞DNA。固定細(xì)胞并進(jìn)行通透處理。使用抗EdU抗體或Click-iT EdU檢測(cè)試劑盒檢測(cè)摻入的EdU。通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)EdU陽性細(xì)胞。

4.細(xì)胞周期蛋白和CDK抑制劑檢測(cè)：

原理：細(xì)胞周期中的不同階段，特定的細(xì)胞周期蛋白和CDK抑制劑的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，通過檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)可以分析細(xì)胞周期。

操作步驟：收集細(xì)胞并進(jìn)行固定和通透處理。使用特異性抗體檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白和CDK抑制劑的表達(dá)。通過免疫熒光或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

這些方法各有優(yōu)勢(shì)，選擇哪種方法取決于實(shí)驗(yàn)的具體需求和可用設(shè)備。例如，PI染色法適用于固定細(xì)胞的DNA含量分析，而Hoechst 33342染色法則適用于活細(xì)胞的分析。EdU摻入法可以提供關(guān)于DNA合成動(dòng)態(tài)的信息，而細(xì)胞周期蛋白和CDK抑制劑的檢測(cè)則有助于了解細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制
 

（5）克隆形成

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是一種重要的技術(shù)方法，用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力、侵襲性以及對(duì)殺傷因素的敏感性。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)涉及到將單個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)，使其增殖并形成可見的細(xì)胞集落或克隆。
單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，形成細(xì)胞集落或克隆。克隆形成率反映細(xì)胞的群體依賴性和增殖能力。通過計(jì)數(shù)克隆形成率，可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力進(jìn)行定量分析。

通過檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后的克隆形成能力，以判斷干預(yù)是否影響細(xì)胞的增殖和存活能力。驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物、放療等在增殖能力方面的敏感性。評(píng)價(jià)細(xì)胞在體內(nèi)成瘤性，克隆形成能力越強(qiáng)，表明體內(nèi)成瘤性越強(qiáng)。硬平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，如正常培養(yǎng)的細(xì)胞。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)：適用于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如某些惡性腫瘤細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)步驟：

制備細(xì)胞懸液：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，吹打成單個(gè)細(xì)胞，并懸浮在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。

接種細(xì)胞：將細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度倍數(shù)稀釋后，接種到培養(yǎng)皿或6孔板中，每個(gè)培養(yǎng)皿或孔中接種一定數(shù)量的細(xì)胞。

培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿或孔板置于37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。

固定和染色：當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。用PBS小心浸洗，然后用多聚甲醛固定細(xì)胞，再用結(jié)晶紫或Giemsa染液染色。
計(jì)數(shù)和分析：在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，研究人員可以深入了解細(xì)胞的生物學(xué)特性，為生物醫(yī)學(xué)研究提供重要信息。
 

（6）細(xì)胞侵襲/遷移

細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)可以幫助我們理解細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下的移動(dòng)能力，尤其是在腫瘤學(xué)研究中，這些實(shí)驗(yàn)對(duì)于揭示腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力至關(guān)重要。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（Scratch Assay）

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種模擬體外傷口愈合過程的方法，用于評(píng)估細(xì)胞在二維平面上的遷移能力。實(shí)驗(yàn)步驟通常包括：

①細(xì)胞生長(zhǎng)至形成單層。

②使用微量移液管頭或其他工具在細(xì)胞單層中劃出一條直線，形成“劃痕”。

③用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃出的細(xì)胞碎片。

④將細(xì)胞置于無血清或低血清培養(yǎng)基中，以刺激細(xì)胞遷移以填補(bǔ)劃痕區(qū)域。

⑤在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)（例如0, 12, 24小時(shí)）拍照記錄劃痕的愈合情況。

⑥通過計(jì)算進(jìn)入劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量或劃痕愈合的面積來評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell Assay）

Transwell實(shí)驗(yàn)是一種用于評(píng)估細(xì)胞在三維空間中的遷移和侵襲能力的方法。實(shí)驗(yàn)步驟通常包括：

①細(xì)胞饑餓處理，通常通過撤血清實(shí)現(xiàn)。

②在Transwell小室的上室中涂抹一層基質(zhì)膠（如Matrigel），模擬細(xì)胞外基質(zhì)。

③將細(xì)胞懸液加入上室，而下室中加入含血清的培養(yǎng)基作為化學(xué)吸引劑。

④將裝置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)嘗試穿越基質(zhì)膠和多孔膜進(jìn)入下室。

⑤培養(yǎng)一定時(shí)間后，清除上室中的細(xì)胞，并對(duì)下室中的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。

⑥使用顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)穿過多孔膜的細(xì)胞，以評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。

這些實(shí)驗(yàn)方法的選擇取決于研究的具體需求，例如，是否需要模擬細(xì)胞在三維環(huán)境中的行為，或者是否需要評(píng)估細(xì)胞對(duì)特定化學(xué)吸引劑的反應(yīng)。通過這些實(shí)驗(yàn)，研究人員可以深入了解細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供重要信息。

 

（7）細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)降解和回收的過程，它涉及到細(xì)胞內(nèi)容物被雙層膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬體，然后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，最終在溶酶體中被降解。這一過程對(duì)于細(xì)胞成分的更新和細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下的生存至關(guān)重要。

細(xì)胞自噬的研究方法包括：直接電鏡觀察、基于LC3/Atg8的檢測(cè)、基于p62/SQSTM1的檢測(cè)、GFP-LC3單熒光自噬指示體系、mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示體系、Western Blot檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)、自噬誘導(dǎo)和抑制劑、饑餓誘導(dǎo)。

在進(jìn)行細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要注意的是，任何一種方法單獨(dú)應(yīng)用均不能作為自噬的依據(jù)。對(duì)任何方法得到的結(jié)果進(jìn)行解釋時(shí)必須慎重，特別是不能將自噬體的增多減少或自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的高低等同于自噬的增強(qiáng)或減弱。

 

（8）原代細(xì)胞分離培養(yǎng)

原代細(xì)胞分離培養(yǎng)是一種從生物體中提取組織或細(xì)胞，并在體外環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)涉及多個(gè)步驟，包括取材、分離、培養(yǎng)和鑒定。

原代細(xì)胞培養(yǎng)相比于細(xì)胞系，更能代表所來源的組織細(xì)胞類型，并表達(dá)組織的特異性特征，因此在藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn)中效果很好。然而，原代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，繁殖代數(shù)有限，通常只能傳10代以內(nèi)，且培養(yǎng)過程比較復(fù)雜。

在實(shí)際操作中，可能需要根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整培養(yǎng)條件和步驟。例如，對(duì)于特定的細(xì)胞類型，可能需要特殊的培養(yǎng)基或生長(zhǎng)因子。此外，原代細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇也是重要的技術(shù)環(huán)節(jié)，以便于長(zhǎng)期保存和使用。

 

（9）流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種測(cè)量流動(dòng)中細(xì)胞或顆粒的物理或化學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。它具有多個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括單細(xì)胞水平的多參數(shù)同時(shí)測(cè)量、高速檢測(cè)能力（高達(dá)每秒數(shù)萬個(gè)細(xì)胞）、定量分析能力以及對(duì)混合細(xì)胞進(jìn)行分離純化的能力。流式細(xì)胞術(shù)可以處理成懸浮細(xì)胞/顆粒的樣本，如外周血、骨髓、細(xì)胞穿刺液、實(shí)體組織、培養(yǎng)細(xì)胞等。

流式細(xì)胞術(shù)通過測(cè)量流動(dòng)的細(xì)胞/小顆粒通過檢測(cè)點(diǎn)時(shí)與激光相互作用產(chǎn)生的散射光和熒光，從而得到各種特征參數(shù)的儀器。它能夠分析和分選的樣本類型包括但不限于外周血、骨髓、細(xì)胞穿刺液、實(shí)體組織、培養(yǎng)細(xì)胞等。可以用來檢測(cè)細(xì)胞表型、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等。

流式細(xì)胞術(shù)是一種強(qiáng)大的工具，能夠提供關(guān)于細(xì)胞群異質(zhì)性的卓越解讀，并且可以用于多種細(xì)胞分析應(yīng)用，如細(xì)胞表型分析、細(xì)胞健康狀態(tài)和存活率等。